SIA Lab-On-Valve&SIA Lab-On-Valve フローセル

SIALab-On-Valve

2方向の断続的な流れをプログラムできるSIAの機構は、SIAマニホールドを小型化し、サンプルの配管とフローセルをコンパクトな一体構造にし、従来のマルチポジションバルブ上に装着することにより一層優れたものになりました。

SIALab-On-Valveを使用してもSIA操作の原理は変わりませんが、マニホールドをさらに小型化しフローセルを内蔵することにより次の構成部が不要になり、システム全体が小型化し、サンプル、試薬、廃液の一層の削減につながります。

● サンプリングライン
● 反応コイル
● 外部フローセル及び配管

図1 ： SIALab-On-Valveマニホールド模式図	図2 ： SIALab-On-Valveマニホールド写真

廃液槽 （#1）、フローセル （#2）、サンプルフロースルーポート （#5）のようにポートにそれぞれ機能を特定し、フローセルまでの流路の内容積を最少化し固定すると、ソフトのプロトコルも統一され、類似した分析にも簡単に使用できます。

サンプリングラインがなく、サンプル溶液は補助ポンプでフロースルーポート （#5）へ供給されるので、シリンジポンプが混合ゾーンを保持コイルへ吸引して、反応処理する間でもサンプルの交換が可能です。従ってサンプリングの回数が増え、サンプル消費量も削減できます。

SIALab-On-Valveシステム構成部分は、従来のSIAよりも小型化しています。500µLのシリンジでマニホールドとフローセルを十分フラッシングできます。
340µLの保持コイル（170cm、オレンジ）に、サンプル・試薬・スペーサーゾーン混合液を合わせて最高150µLまで保持できます。
廃液槽へのチューブ（緑）内径は背圧を抑えるために0.75mmとより大きく、キャリア容器からシリンジポンプのインレットにつながるチューブは、シリンジへの急激な吸入で圧力がかかったり空気の泡が発生したりしないよう内径1mm（茶）のものを使用します。
一般的に一回の分析で必要な試薬量は20µLなので、2mLの使い捨てシリンジをポート （#6）へステンレスチューブで接続して試薬の容器として使用します。
全ての接続チューブはポートの奥まで差しこみデッドボリュームが無いようにします。
使用しないポートは、ペンチで閉じたチューブ（長さ5cm、黄）で栓をします。

SIALab-On-Valveフローセル

図3 ： 光ファイバーを使用したSIA用マルチ機能フローセル

ポート （#2）のフローセルには、三流路あります。UV-VIS分光光度計用のセルは、ステンレス鋼チューブで覆われた光ファイバー2本を利用しています。
（図3左）短路吸光で使用する場合、2本の光ファイバー先端部の間隔は1.5mmあり、フローセル容量は2µLです。上部の流路はチューブ（黄）で栓をしてあり、モニターされる流れはファイバー間を通ります（緑の矢印）。
光ファイバーを内蔵するステンレス鋼チューブとその配管部内側の間に15µmの隙間がもうけてあります。このため、長い光路で使用する際、流れは上部の光ファイバーの周りを通るので、光路長は10mmにすることができます。
蛍光検出及び蛍光／吸光検出だけでなく化学発光測定にも使用できます。

ストップドフロー法（SIA）

化学反応によって、反応物が生成される速度は異なります。一般的に、試薬を使用する殆どの化学反応では室温で混合して数秒後には測定可能な量の反応物が生成されます。
FIA及びSIAの利点は、化学反応物の生成が平衡に達しない時にも再現性のある有効なデータが得られることです。
必要なのは、形成された反応生成物が、標準溶液から形成される反応物と相関を持つことです。

SIAで使用する際、2つの方法があります。

① 混合後すぐに反応物が生成される場合は、混合ゾーン（図8）はそのまま続けてフローセルへ送ることができ、従来のFIAピークと非常に近いデータが得られます。その形状は黄色のゾーン部分に相当し、ピークの高さはアナライトの濃度に比例します。

② 反応の進行が遅い場合には、送液を停止することで混合ゾーンを検出部にとどめることができます（図4）。送液を停止している間の反応速度はモニターされ、反応速度曲線の傾きはアナライトの濃度に比例します（図4）。ストップドフロー法の利点は、反応時間を長くでき、試薬を節約でき、バックグラウンドのノイズを消すことができることです。

反応速度に関係無く、同じように下記の通り実行できます。

図4 ： 単一試薬分析プロトコルでの一般的な流量及び容量

2つの試薬を使用する場合、スペーサーは2番目の試薬に置きかえられます。
システムへの充填及びフラッシングは高流速で、サンプルと試薬の計量及び注入は低流速で、またフローセルで最大ピークのデータ回収時は低流速で行います。

システムのプライミング

図5 ： SIALab-On-Valveストップドフロー法 TP−流れを切り換えるタイミング R−試薬 S−サンプル

最初にシリンジポンプを、次いで保持コイル、バルブ、フローセルをキャリアで満たします。サンプルと試薬ポートから吸引して保持コイルへプライミングします。保持コイル、バルブ、フローセルをフラッシングしてサンプルと試薬を取り除きます。

SIAストップドフロー法のユニークな特長は、反応条件の自動最適化をコンピューター制御で行えることです。サンプル・反応物及び試薬の混合ゾーンを選択し、フローセル内にとどめ、反応速度をみて送液を停止するタイミングを決めます。設定した量のキャリアを流し、フローセルへ混合ゾーンを押し出すことで、高い再現性と精度が得られます。反応速度を調節する要因としては、常に同じ切り換えポイント（保持コイルに連続吸入した混合ゾーンの合計量）を選択し、送液停止位置での逆送液量を変えることがあげられます。これによりサンプルゾーンのピークの後で反応速度を選択できます。

図6 ： 使用例 ：グルコースの酵素アッセイのモニター 光路長5mmのフローセル、分光光度計波長337nm

グルコースの濃度を上げながら実験的に7回行った際の反応速度曲線が図6にあります。この曲線のデータ処理・図表示はFIAlabソフトによるものです。ブランクは水平線ですが、グルコースの濃度を増加すると反応速度曲線の傾きも上昇します。

グルコース、アンモニア、グリセロール、リン酸、硝酸及び亜硝酸のアッセイ用メソッド及び試薬組成の詳細、サンプルと試薬の量、ソフトのプロトコルの詳細は発表されています。
この関連文献はwww.flowinjection.comの“Database"で見ることができます。