SIA（シーケンシャルインジェクション分析法）・BIA （ビーズインジェクション）

SIA（シーケンシャルインジェクション分析法）

SIAは精密に設定したニ方向の不連続な流れをコンピューターでプログラミングして処理します。
サンプルゾーンと試薬は、マルチポジションバルブを利用しながら一つのシリンジポンプによってキャリアの流れへ連続的に注入します。
SIAは試薬の消費量を大幅に減らすことができます。従来のFIA装置は、サンプルが処理されない間もポンプが連続作動するために、SIAシステムより試薬を大量に消費します。
Lab-On-Valveを使用したFIAシステムをストップドフロー法で行った場合でも少しは軽減されますが、ペリスタルティックポンプはマイクロリットル単位で送液することができません。
またFIAはBIA （Bead Injection Analysis） には対応できません。


分析プロトコルは図1・2に示されたシーケンスから構成されます。

A： 設定した量のサンプル溶液（赤）がシリンジポンプでサンプルポートから保持コイルへ吸入されます。 B： 設定した量の試薬（青）がシリンジポンプで試薬ポートから保持コイルへ吸入されます。連続したゾーンが上流へ移動する間にゾーンの重なり部分に反応物（黄）が生成されます。 C： 重なったゾーンの相互浸透を増加させ、反応物の生成を促すため、設定した量の“スペーサー”を吸入します。 D： 流れを逆にして重なったゾーンはマルチポジションバルブを介して検出器へ送られ、さらに廃液槽へ送られます。
	図1 ：SIAの原理

上記の全てのステップは、マルチポジションバルブを適切なポートに切り換えることと、コンピューター制御のシリンジポンプの正確な動きによって実行されます。

保持コイル、マルチポジションバルブ、反応コイル及び検出器内でのサンプルゾーンと試薬ゾーンの動きは24,000ステップのシリンジポンプによって制御されます。 一般的に、SIAシステムの構成は、2.5mLのシリンジ、550µLの保持コイル（120cm、緑）、100µLの反応コイル（50cm、オレンジ）です。 フローセルの容量は25µLを越えません。保持コイルには、サンプル・試薬・スペーサーゾーンを合わせて最大250µLまでをシリンジへ吸引させることなく続けて取り込むことができます。 この連続ゾーンの量を超える場合には保持コイルの容量も増やします。
	図2 ： 従来のSIA用マニホールド （R-試薬ポート、RC-反応コ イル、S-サンプルポート、T-サンプルライン接合点）

シリンジ容量はマニホールドとサンプリングラインのフラッシングに十分なキャリアを流せる容量です。
廃液槽と試薬容器ポートにつながるチューブの長さ及び内径は重要ではありませんが、サンプリングラインは前のサンプルのキャリーオーバーを防ぐために、最小化しなければなりません。


サンプルポートSと接合点Tの間のサンプリングライン（図1赤線）は別のサンプルにする前に1度フラッシングしてから次のサンプルで2回分満たす必要があります。次の2通りがあります。

1 ） サンプリングラインからバルブを通してサンプル溶液を吸引すると次のサンプルがポートSまで送られます。コンタミしたサンプルはポート1から廃液槽へ捨てます。

2 ） サンプリングラインをキャリア液でフラッシングしてから次のサンプルをサンプルポートから保持コイルへ吸引して再充填します。ペリスタルティックポンプは、サンプル容器（サンプラー）と接合点の間の配管（青線）を通してサンプル溶液をサンプリングライン接合点（T）へと移動させるようプログラムします。

サンプリングラインS〜Tをシリンジポンプでフラッシングするために、FIAに比べてサンプリング回数が少なくなります。しかしSIAは、試薬の消費量を減らし、システムを組立て直す必要もなく同じマニホールドを異なる分析プロトコル用に使用でき、用途の多様化を図れる等の利点があります。サンプル量、試薬の量、希釈、反応時間等は全てFIAlabソフトでコンピューター制御できます。

BIA （ビーズインジェクション）

この技術は伝統的な試薬溶液を使う分析と固相を使う分析の両方に適用できます。
従来の固相の化学的誘導性とマイクロ送液によるビーズの流動性を組み合わせて、選択的にアナライトの分子を捕え、検出し、溶出することができます。また、反応基は入れ替えることができます。
言い換えれば、BIAとは、アナライトをオンカラムでリアルタイム モニタリングでき、必要に応じて溶出でき、ビーズを自動充填できるマイクロ クロマトグラフィーと言い換えられます。
SIA Lab-On-Valveでマイクロ送液すると固定相の廃棄だけでなく再充填もできます。

マイクロ送液プロトコルは5段階から構成されます（図3）。 Step 1：浮遊するビーズ（通常10µLの20%v/vビーズ懸濁液）の所定量をマイクロコンデュイットへ注入し、任意の位置にとめてマイクロカラムを作ります。 Step 2：サンプル溶液（赤）を注入して充填したビーズへ送ります。 ③Step 3：ビーズ表面の反応基とアナライト分子の反応が起こり、ビーズの光学的または電気化学的な状態に変化が起こります。 Step 4：サンプルゾーンは流されていくので、アナライト以外のサンプル成分は取り除かれます。 Step 5：ビーズも廃棄されます。
	図3 ：BIAの原理

ビーズインジェクションフローセル吸光法

図4のフローセルは“ストップドフロー法（SIA）” のフローセルの位置と比べて90度回転させた状態です。 FIAlab-3500を横に倒し、フローセルに粒子充填を簡単に行うためです。 栓に使うチューブ（3mm）は使用する粒子サイズで決めます（チューブ：黄、175µmまたは透明、65µm）。この栓はチューブ（緑）の先にいれて液体はこの栓の周りと中心を通り、ビーズはフローセルにとどまります。 順送の流れでビーズを充填させ、逆送で廃棄することができます。
	図4 ：UV-VIS光度計モニター用光ファイバーフローセル

現在ニつの方法があります。
一つはアナライト分子の吸着・溶出中のビーズの光学特性モニターです。
もう一つは交換可能なマイクロカラムと呼ばれ、質量分析装置のような別の機器へアナライトを溶出させるか、さらに分析するために黒鉛炉へ粒子を送りこみます。
一つ目の方法例として、図5にラベルをつけたIgGをセファロースGビーズに吸着させ、溶出させたUV-VIS光度計測定の例を示してあります。

UV-VIS分光光度計でビーズをモニターする際、FIAlabソフトでフローセルにビーズを充填した後に、全てのスペクトルをゼロにしてベースラインをひくことができます。 この操作で検出器はマイクロカラムを見えないものとし、次に記録されるスペクトルはサンプル成分の光学データとなります。 セファロースGにIgGというようにアナライトを選択的にとらえるので検量線を描けます。従って、非常に高価で複雑な表面プラズモン共鳴装置に現在のところ頼っているバイオリガンド相互作用アッセイにも応用できます。
	図5 ：バイオリガンド相互作用アッセイ セファロースGを充填した後、ベースラインをゼロにして吸光度の測定を開始。 2.5mgのIgG入りのサンプル20mLを注入し、Exposureの間に蛋白質が吸着。PBSバッファーで洗浄。 殆どのIgGを保持。IgGは273nmでモニター。 ラベルのFITCは480nm及び500 nmの吸収。